在分子生物學(xué)研究中，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)因其高靈敏度、操作便捷和結(jié)果可靠，被廣泛應(yīng)用于啟動子活性分析、miRNA靶基因驗(yàn)證、轉(zhuǎn)錄因子功能研究等領(lǐng)域。然而，實(shí)驗(yàn)過程中常常會遇到各種問題，例如熒光值異常、重復(fù)性差等，這些問題可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了幫助大家更好地掌握這一技術(shù)，我們整理了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)中的常見問題與解答，涵蓋了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作細(xì)節(jié)、數(shù)據(jù)分析等多個方面，希望這些內(nèi)容助您輕松搞定實(shí)驗(yàn)！

Q1:雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)可應(yīng)用于哪些研究方向？

A1:①驗(yàn)證microRNA同mRNA靶向互作；②驗(yàn)證microRNA同lncRNA/circRNA靶向互作；③驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作；④啟動子結(jié)構(gòu)分析⑤啟動子SNP分析

Q2:如何選擇報(bào)告基因載體？

A2:螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因（內(nèi)參）在同一個載體上，選擇pmirGLO等載體；螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因（內(nèi)參）分別在一個載體上，可選擇pGL3/pRL系列載體；載體詳細(xì)信息可參考【干貨分享】手把手教你做雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。

Q3:如何選擇主報(bào)告基因和內(nèi)參基因的質(zhì)粒比例？

A3:通常，主報(bào)告基因質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒的比例，建議作一個預(yù)實(shí)驗(yàn)來調(diào)整（如螢火蟲載體與海腎載體比例分別用1：10、1：20、1：50、1：100），確保內(nèi)參基因被準(zhǔn)確檢測且不干擾主報(bào)告基因的表達(dá)。

Q4:如何保證檢測數(shù)據(jù)的有效性和真實(shí)性？

A4:①設(shè)立對照和重復(fù)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的有效性且需要做3個或3個以上復(fù)孔，并且引入另一個報(bào)告基因作為內(nèi)參，主要是同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動，排除多種干擾因素的影響（細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染效率、載體質(zhì)量、裂解速度、加樣精準(zhǔn)度等）。②熒光值控制：熒光值過高可能會超出儀器的檢測范圍，導(dǎo)致無法檢測到值，一般建議將熒光值控制在5-6位之間。

Q5:熒光值過高或過低怎么辦？

A5:熒光值過高：可減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量，或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測;熒光值過低：可能是轉(zhuǎn)染效率低或裂解不充分，建議優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件、增加細(xì)胞量或延長裂解時(shí)間。

Q6:復(fù)孔間重復(fù)性差如何解決？

A6:確保樣本均一性，裂解后離心取上清檢測；定期校準(zhǔn)移液器，保證加樣準(zhǔn)確性；轉(zhuǎn)染時(shí)混合的力度/細(xì)胞量/時(shí)間等保持一致（同個數(shù)量級內(nèi)的差異是可以接受的）。

Q7:雙熒光素酶檢測需要使用什么檢測板？

A7:建議使用全白板，優(yōu)勢是靈敏度最高而且孔間相互干擾最小。

Q8:雙熒光素酶檢測需要使用什么儀器？

A8: 化學(xué)發(fā)光儀或帶化學(xué)發(fā)光檢測模塊的酶標(biāo)儀。

Q9:海腎和螢火蟲是在同一個孔里面檢測嗎？能否分開檢測？

A9:同一個孔里檢測，不會相互影響，蘭博利德的海腎熒光素酶底物中有淬滅螢火蟲熒光值的物質(zhì)?？梢苑珠_檢測，但是在一個孔里檢測會更加準(zhǔn)確。

Q10:實(shí)驗(yàn)過程有哪些注意事項(xiàng)？

A10:①樣品混勻：保證裂解產(chǎn)物與底物快速混合、混合時(shí)間一致，避免熒光素酶衰變的影響。②細(xì)胞裂解產(chǎn)物處理：細(xì)胞裂解產(chǎn)物常溫不超過6小時(shí)；-20℃一個月；-80℃半年。    ③反應(yīng)體系：雙熒光素酶反應(yīng)體系：20?μl（細(xì)胞裂解產(chǎn)物）、100?μl（螢火蟲熒光素酶底物）、100?μl（海腎熒光素酶底物），底物量可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，但一定要保證底物過量，不然會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

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