細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品貨號：C1002-50T

存儲條件：-20°C避光，有效期24個月

產(chǎn)品說明：

細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidium Iodide staining)方法進行細胞周期與細胞凋亡分析。

碘化丙啶(Propidium Iodide，簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。

碘化丙啶染色后，假設(shè)G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA復(fù)制的S期細胞的熒光強度為1-2之間。凋亡細胞由于細胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA片段化(DNA fragmentation)導(dǎo)致部分基因組DNA片段在染色過程中丟失，因此凋亡細胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染，即熒光強度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細胞峰。

細胞發(fā)生凋亡時，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細胞凋亡的早期，細胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號均降低。因此可通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化觀察細胞凋亡情況。

本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與細胞凋亡檢測。如果用于組織的細胞周期與細胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細胞狀態(tài)，才可以進行檢測。

本試劑盒足夠檢測50個樣品，每個樣品的細胞數(shù)量可以為10-100萬。

注意事項：

1）本試劑盒需要使用流式細胞儀進行檢測。需自備PBS和70%乙醇。

2）細胞處理需輕柔，盡量避免人為的損傷細胞。

3）為防止不同批次細胞在實驗時所處周期不同導(dǎo)致重復(fù)性差，可以在實驗前進行細胞的同步化處理。實驗細胞應(yīng)處于對數(shù)生長期，貼壁細胞一般在50～80%匯合度時收集為宜。

4）400目篩網(wǎng)過濾是用來將粘在一起的細胞團濾掉，留下單細胞，否則會出現(xiàn)人為的多倍體干擾。如果沒有條件過濾，請在染色之前將細胞輕彈以分散，再進行染色。

5）熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6）碘化丙啶對人體有刺激性，操作碘化丙啶時，應(yīng)注意防護，保護眼睛、避免吸入。

7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品組成：

使用方法：

1. 細胞樣品的準備：細胞數(shù)量控制在1×105~1 × 106個。

a）貼壁細胞：小心吸除細胞培養(yǎng)液，用胰酶消化細胞，制備成單細胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細胞，棄上清，用1 mL預(yù)冷的PBS潤洗細胞一次，離心收集細胞。

b）懸浮細胞：1000 g離心5 min，沉淀細胞，小心吸除上清。加入1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心收集細胞。

c）組織細胞：將組織塊用剪刀剪成盡量小的小塊后，用0.25%的胰酶消化0.5-1 h，經(jīng)過200-400目篩網(wǎng)過濾得到單細胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細胞。加入約1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。如組織難以消化，可加入適量膠原酶。

2. 細胞固定：

細胞沉淀用1 mL預(yù)冷的70%乙醇輕輕混勻，4℃固定2 h以上或者過夜。然后1000 g左右離心5 min沉淀細胞后，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的70%乙醇，以避免吸走細胞。

加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸。然后再次1000g離心5 min沉淀細胞。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS，以避免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

3. 碘化丙啶染色液的配制：

對于1個樣品，在0.5 mL染色緩沖液中加入25uL 碘化丙啶儲液和10uL RNase A溶液，混勻待用。其它數(shù)量的樣品參考下表，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液：

注：配制好的碘化丙啶染色液短時間內(nèi)可以4℃保存，宜當日使用。

4. 染色：

每管細胞樣品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，輕輕混勻重懸細胞沉淀，37℃避光孵育30分鐘，就可以進行流式檢測，流式檢測最hao在5h內(nèi)完成。

5. 流式檢測和分析：

用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。